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汇报人：王灵鑫 日 期：2025 . 12 . 5

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TKI与ICI确实显著改善了mRCC（转移性肾癌）疗效（ORR 55-70%），但两个根本矛盾未解决——

(1) 多数患者最终仍因耐药进展而死亡；

(2) 现有疗法毒性显著，亟需筛选真正获益人群。这暗示了精准分层的临床价值。

列举TMB、PD-L1 IHC、CD8+ T细胞浸润、突变谱、组织学分级及单基因特征，均无法独立区分TKI与ICI的应答者/非应答者。 JAVELIN、IMmotion150/151、CheckMate214等单模态转录组特征虽与结局相关，但跨队列预测一致性差。 批次效应与肿瘤异质性导致特征漂移。不同研究的患者基线、测序平台、治疗方案差异，使单一特征难以稳健泛化。缺乏标准化harmonization框架是核心障碍。

改进多模态生物标志物方案的迫切性，并强调元队列分析（meta-cohort）的重要性。这是从”单研究拟合”到”大样本学习”的方法论跃迁。

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“图 1a 显示了 WU-RCC 队列中患者按首次一线治疗分组的分布情况。横向来看，样本被分为主要的治疗组——包括 TKI（tyrosine kinase inhibitor，酪氨酸激酶抑制剂）、ICI（immune checkpoint inhibitor，免疫检查点抑制剂）以及 ICI+TKI 联合治疗等。这个分布直接说明了我们样本覆盖了当前 ccRCC 的主流治疗策略，因此后续基于此队列的分子学关联分析具有临床相关性。

图 1b 是 oncoplot，展示了样本的基因突变和拷贝数变异（copy number alteration）情况，并在热图上方注释了 TMB（tumor mutational burden，肿瘤突变负荷，单位 mut/Mb）、染色体臂拷贝数变化、治疗类型、RECIST 反应和分级（grade）。从图中可以看出一些基因事件（例如 BAP1、SETD2、MTOR 等）的分布不均匀，并且与临床特征存在关系。

需要强调的名词：TMB = 肿瘤突变负荷，RECIST = Response Evaluation Criteria in Solid Tumors，一般用来定义 CR（complete response，完全缓解）、PR（partial response，部分缓解）、SD（stable disease，疾病稳定）和 PD（progressive disease，疾病进展）。这一图体现了基因组学层面与临床结局的初步关联，但单靠这些基因还不能完整预测治疗反应。”

图 1c 用饼图分别比较了在 ICI/ICI+TKI 组、TKI 组和未治疗组中，Rs（CR全缓+PR部缓）与 NRs（SD+PD）在 BAP1、SETD2、MTOR 三个基因上的突变比例。关键观察：例如 MTOR 突变患者在 ICI 组中显示较低的响应率（提示 MTOR 激活可能与 ICI 抵抗相关），而 BAP1、SETD2 的分布也与不同治疗响应呈现某种趋势。统计检验采用卡方检验（chi-square test）。结论回顾：单一基因改变会影响疗效倾向，但并不足以作为独立的预测生物标志物，需与转录组和微环境特征结合分析。

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Characteristics of the WU-RCC cohort

既然我们已经了解了不同治疗组中的基因突变分布，下一步，我们将深入探讨肿瘤微环境（TME）对治疗反应的影响，尤其是免疫细胞和细胞因子的作用，有利于我们进一步预测和理解治疗效果.

缩写解释：FGES = functional gene expression signature（功能性基因表达特征）；scRNA-seq = single-cell RNA sequencing（单细胞转录组测序）

“图 1e 是基于 harmonized scRNA-seq（共 259,441 个细胞）计算出的 FGES 与细胞因子表达热图。横向是细胞类型（例如 T 细胞、NK 细胞、单核细胞/巨噬细胞、上皮细胞等），纵向是若干功能性基因集（FGES）与细胞因子。

图示显示：激活的 T 细胞和 NK 细胞富含与抗肿瘤免疫相关的 FGES（例如杀伤/细胞毒相关基因）并表达 CCL4、CCL5 等趋化因子，这些与 ICI 响应正相关；而髓系细胞（monocytes，macrophages）表达抑制性因子例如 CXCL8（即 IL-8），这与 ICI 不响应相关。”

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Characteristics of the WU-RCC cohort

“图 1f 展示了使用 Kassandra 工具对 前面的bulk RNA-seq 数据进行去卷积（deconvolution）后得到的细胞类型组成比例。每个样本的条形或热图标注不同细胞类型（例如内皮细胞、T 细胞、B 细胞、巨噬细胞等）的占比。重要发现：在 ICI 响应者中效应 T 细胞占比较高，而内皮细胞在 ICI 响应者中趋势性下降（即血管成分减少可能与更好的免疫渗透/响应相关）。这里要说明：Kassandra 是一种基于参考签名的去卷积算法，用于从 bulk 数据估计细胞组成。”

1g（PDL1-positive 免疫细胞 IHC、IFNG、细胞因子 FGES、效应 T 细胞 FGES、血管生成 FGES 在 Rs vs NRs 中的比较）：

“图 1g 具体定量了几项关键指标在 Rs 与 NRs（按 ICI、TKI 或未治疗分组）之间的分布。统计采用 Mann–Whitney U 检验。

要点：ICI 响应者显示更高的 IFNG 与细胞毒性/效应 T 细胞 FGES；而血管生成 FGES 在 Rs 与 NRs 之间并无显著差别，说明单纯的血管生成信号不足以预测 ICI 响应。”

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Figure 2. Development of ccRCC HiTME subtypes

HiTME = harmonized immune tumor microenvironment（统一的免疫肿瘤微环境分型）；

ECM = extracellular matrix（细胞外基质）；

CAF = cancer-associated fibroblast（癌相关成纤维细胞）；

EMT = epithelial-mesenchymal transition（上皮-间质转化）

前面研究了免疫细胞和细胞因子在免疫疗法中的关键作用，接下来我们将通过整合不同的临床转录组数据，构建 HiTME 分型系统，这有助于进一步揭示治疗反应的异质性并为临床分类提供更精确的模型。

通过整合 14 个队列构建了迄今最大的 ccRCC 转录组联合数据库（n = 3,621），并基于 33 个 FGES 进行了密度-聚类，定义出五种 HiTME（harmonized immune tumor microenvironment）亚型：IE/M、IE、F、V、D。（免疫富集（IE）、免疫富集-髓系（IE/M）、纤维化（F）、血管化（V）和免疫荒漠（D）型）这些亚型在细胞组成、功能通路和预后上存在显著差异。特别是免疫富集型（IE）亚型通常具有更好的免疫反应，而纤维化型（F）则与不良预后相关。

图 2b 展示了在整合流程中如何进行归一化：左图是原始基因表达矩阵的 PCA，可见不同批次分离明显；中图是基于 33 个标准化 FGES 得到的 PCA，批次效应显著降低；右图则按 HiTME 亚型绘制，显示基于 FGES 的样本聚类比基因表达原始矩阵更能反映生物学差异。这一步强调：使用功能性特征（FGES）代替逐基因表达有助于降低技术噪声和批次效应。

图 2c 是 3,621 个样本的热图聚类结果，清晰分成 5 个 HiTME 亚型：IE/IE-M 亚型富含 CD8+ T 细胞与免疫检验点表达，V 型富含血管与内皮相关信号，D 型富含代谢相关基因簇（例如糖酵解、TCA 循环），F 型和 IE-M 有较高的 CAF/ECM/EMT 信号，提示纤维化与髓系抑制相关联。

图 2d 用气泡图展示每个 HiTME 亚型在细胞成分占比和基因表达（代表性基因/通路）方面的差异。气泡大小代表 p 值，小气泡意味着显著性更高，颜色代表平均表达水平或比例尺度。

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Figure 2. Development of ccRCC HiTME subtypes

接着我们通过与 CPTAC 和 IMmotion151 数据集的比较，验证了 HiTME 分类系统的稳定性和预测能力。

图 2e （在前一页）是柱状图，将 HiTME 的样本映射到 CPTAC 与 IMmotion151 的既有分型上，展示各分型之间的重叠。例如，CPTAC 的 CD8+ inflamed 大多落入 IE / IE-M；CPTAC VEGF/immune-desert 多数对应 V 型；IMmotion151 的 Angio/Stromal 与 V 型或 IE/D 型存在一定重叠。这个对比说明 HiTME 在大数据集上具有生物学合理性，同时也补充了以前分类未能覆盖的“髓系/纤维化”维度。

图 2f 展示在 TCGA-KIRC 和 Sato 等队列中按 HiTME 分层后的总体生存（OS）Kaplan–Meier 曲线。结果显示纤维化相关的 IE/M 与 F 亚型生存最差（统计学上多比较对比使用 log-rank 测试），而 immune-enriched 或高血管化亚型生存相对更好。这提示 HiTME 不仅反映分子特征，也与长期临床结局相关。

图 2g 比较了在 JAVELIN 和 IMmotion151 两个队列中，按 HiTME 分层的 PFS（对比 sunitinib 等 TKI 与 atezolizumab/bevacizumab 等 ICI+AA 的结果）。要点：IE 与 IE/M 在 ICI 或 ICI+AA 联合治疗中 PFS 明显更长（即更易获益），而 F 型在不管什么疗法 PFS 最短是最拉的，表明纤维化/髓系抑制亚型对 ICI 不敏感或对单独 TKI 效果差。统计学差异在图中以 p 值标注。

CPTAC = Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium；

IMmotion151 / IMmotion150 =两个重要的ccRCC临床试验/转录组研究数据集；

OS = overall survival（总体生存）；

PFS = progression-free survival（无进展生存）；

AA = anti-angiogenic agent（抗血管生成药物）。

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Figure 3. Validation of ccRCC HiTME subtypes with MxIF

既然我们已经证实了 HiTME 分型在临床预后中的重要性，接下来我们将利用多重免疫荧光（MxIF）技术进行空间验证，分析肿瘤微环境中免疫细胞的空间分布及其与 HiTME 亚型的关系

图 3a 给出 MxIF 的处理流程：首先取手术切片做 H&E，选择 15 个 ROI（感兴趣区）；对每个 ROI 进行多重荧光染色，随后进行细胞分割（segmentation），然后以 t-SNE 等方法对分割得到的细胞进行聚类与表型注释(作者用 PhenoGraph（k=30） 对 19 个蛋白标记物的单细胞表达矩阵进行聚类，随后用 t-SNE 降维可视化，最终归纳出 8 个主要细胞群（B 细胞、CD4⁺ T 细胞、CD8⁺ T 细胞、内皮细胞、髓系细胞、恶性/上皮细胞等）。)。这个流程的关键是把空间定位的蛋白表达与单细胞级别的表型相结合，从而得到更真实的肿瘤-免疫空间图谱。

b的话 是对分割后不同细胞群体的平均标记表达进行归一化绘制的热图（n = 34 个患者）。每一行是一个细胞群体（例如肿瘤细胞、内皮、T 细胞、B 细胞、不同巨噬细胞群等），每一列是标记（CAIX、PCK26、KI67、CD31、CD8、CD68、CD206 等）。从图中可以看到不同细胞群有明确的 marker 模式，例如内皮细胞高表达 CD31，增殖肿瘤细胞高表达 KI67，免疫细胞表达 CD8 或 CD68 等。

图 3c 展示了一个 MxIF 原图（上皮标记、KI67、CD31、CD8、CD206 等通道）以及基于 tessellation（切分格网）生成的巨噬细胞与血管掩膜。tessellation mask 通常用于在空间上划分邻域并统计局部细胞类型密度，从而分析细胞-细胞相互作用或局部微环境特征。

图 3d 是基于 tessellation mask 或聚类得到的六个髓系（myeloid）簇的平均标记表达热图，用以区分不同功能态的巨噬细胞或髓系亚型（例如 CD206+ M2-like、CD68+ 吞噬性亚群等）。该图主要是把转录组层面的‘髓系抑制’信号对应到具体的免疫细胞表型上。

phenoGraph

U-Net深度学习模型（ResNet-101 backbone）核/膜分割

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Figure 3. Validation of ccRCC HiTME subtypes with MxIF

图 3e 给出依照 HiTME 类别分组的代表性 MxIF 图像：IE/IE-M 常见强免疫浸润与三级淋巴结构（TLS）；V 型显示明显的分叉血管网络；F 与 IE-M 可见更多 CD206+ 或 CD68+ 的髓系细胞和纤维化基质。这些空间形态学证实了转录组层面的亚型划分具有组织学对应性。

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Figure 3. Validation of ccRCC HiTME subtypes with MxIF

在空间验证后，接着分析了 MxIF 和 RNA-seq 数据的相关性，这让我们通过多组学数据整合，能够把肿瘤微环境的免疫特征与治疗反应之间的关系对应起来。

图 3f 汇总展示了 MxIF 基于分割/掩膜得到的细胞类型丰度与 RNA-seq 去卷积（Kassandra）估计的细胞占比之间的对应关系。可以看到 CD8+、CD4+、B 细胞、内皮与巨噬细胞的估计值在两种方法间呈正相关，说明两种平台互为验证，提高了我们对细胞组成结论的可信度。

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Figure 3. Validation of ccRCC HiTME subtypes with MxIF

图 3g 给出若干散点图及对应的 Spearman 相关系数 r 与 p 值：例如 CD8 的 r=0.71（p≈2.7×10⁻⁶），内皮的 r=0.84（p≈4.2×10⁻¹⁰），表明 RNA-seq 的去卷积在识别内皮细胞方面与 MxIF 非常一致；而某些细胞类型（如巨噬细胞）相关性略低但仍显著（r≈0.36）。这说明 MxIF 提供的空间验证对转录组推断非常关键

图 3h 是箱线图，展示了 CD8+ T、B 细胞、髓系 PDL1（PDL1 on myeloid）和内皮细胞在不同 HiTME 中的分布。要点：IE / IE-M 中 CD8+ 与 B 细胞含量最高，且常伴随 PDL1+ 髓系细胞；V、F、D 型的内皮含量/血管化明显更高。这些差异解释了为什么 IE 型更可能响应 ICI，而 V 型对 TKI 更敏感。

图 3i 示意了 IE/M 样本在肿瘤-间质边界处的强免疫浸润，T 细胞通常在边界处富集并对肿瘤细胞呈现杀伤特征（例如 GRB 与 PD1 阳性），提示肿瘤-免疫细胞正在发生接触/免疫攻击，这是 ICI 有效的空间学基础。

图 3j 比较了不同 HiTME 中内皮细胞到 CD8+ T 细胞的平均距离。IE/M 显示较大的平均距离（解释为免疫细胞从血管迁移进入肿瘤的活动），而某些其他亚型可能存在免疫排斥或无法有效进入肿瘤的现象。空间距离作为一个可量化指标，可用于推断免疫细胞迁移/渗透的动态。提示主动迁移而非被动滞留。

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Figure 4. Spatial cellular communities within HiTME subtypes

既然我们已经通过多组学数据确认了 HiTME 亚型与肿瘤微环境的关系，下一步我们将结合空间社区分析，进一步探索 HiTME 亚型与细胞相互作用及其在治疗反应中的作用。

本页展示了基于空间社区分析的结果，我们发现 HiTME 亚型在肿瘤微环境中的空间分布有显著差异。

图 4a 为重建细胞质心邻域图，我们对细胞集合进行了拉氏距离计算。针对每个细胞，我们将边上的相邻细胞识别为邻居，以细胞类别向量形式获取邻域信息，并为每个细胞选择掩膜百分比。随后，利用生成的邻域图，采用Pytorch几何Python包中的DeepGraphInfomax图卷积神经网络进行无监督训练，获得细胞邻域的32维向量嵌入。经过该转换后，使用kmeans算法对邻域向量进行聚类，得到15个不同邻域簇（图4A）

采用基于图的细胞群落分析方法检测WU-RCC样本中的空间细胞间相互作用，展示了如何从单细胞分割结果构建细胞-细胞邻近图（graph），并基于该图进行聚类，最终识别出 15 个社区。

图 4b 左侧是点图，展示每个社区中各种细胞类型的相对比例；右侧热图展示在每个社区邻域中髓系掩膜（myeloid masks）的比例。举例：E1 社区与 KI67+ 肿瘤密切相关；I2 社区富含 CD68+ 巨噬细胞并与 IE/M 亚型相关。

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Figure 4. Spatial cellular communities within HiTME subtypes

图 4c 给出不同社区的代表性 MxIF 分割图与社区注释，例如展示了如何通过细胞类型与空间邻近识别出 T1（T 细胞富集）或 V1（血管相关）等社区。这些直观图像帮助理解抽象社区在组织学上的形态学基础。

图 4d 给出在肿瘤内部与肿瘤-基质边界两类 ROI 中，不同 HiTME 的社区组成差异。总体趋势是：IE/IE-M 更富集于免疫类社区（I2、T1、B1），而 V、D 型更偏向血管/内皮相关社区（V1、E5/V）

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Figure 4. Spatial cellular communities within HiTME subtypes

前面图d是用眼睛在那看，图 4e 使用箱线图数理统计展示了某些社区在特定 HiTME 中的富集显著性（Mann–Whitney U 检验）。例如 I2 在 IE/M 中显著富集（p<0.05），而 E5/V 在 D 型或 V 型中更常见。这些统计关联支持社区-亚型-治疗响应之间的三级对应关系（空间社区 ↔ HiTME ↔ 治疗敏感性）。

图 4f 显示了每个样本在 intratumoral 与 tumor-stroma border 区域中各社区的组成比例（条形堆叠图），从中可以直观看出样本间高度异质性：有些样本以 E1/E3/E5/V 为主（肿瘤/血管占优），另一些样本以 I2、M1 等免疫或髓系社区占优。该图强调：即便在同一 HiTME 类别内，社区组成仍有个体差异，这或与个体治疗反应相关。

图 4g 比较了社区在肿瘤内部（intratumoral）和肿瘤-基质边界（tumor-stroma border）两种 ROI 的富集差异：通常增殖和肿瘤相关社区（E1、E3）位于肿瘤内部，而血管与髓系边界社区（V2、M2、CD11b）多集中在边界处。这种空间分布说明肿瘤-基质交界处是免疫细胞/血管细胞与肿瘤细胞交互的关键位置，对治疗响应有重要影响。

图 4h 给出了 V1（血管化社区）在不同肿瘤分期（stage）间的分布差异箱线图，血管化的V1细胞群随疾病分期显著减少

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Figure 5. ICI and TKI responder score training and validation

这一部分展示了基于机器学习的免疫检查点抑制剂（ICI）反应预测模型的训练与验证过程。通过不同的队列数据，我们构建了一个模型来预测ccRCC患者对ICI治疗的反应。

图5A：模型使用了多个公开队列（如IMmotion151、IMmotion150等）进行训练，并通过JAVELIN等队列进行验证。仅CR与PD用于训练（binary classification），PR/SD作为验证集。

图5B：ICI反应模型在训练数据中的热图，显示了不同特征（如PDCD1、CD274等）在患者中的表达水平。通过这些热图可以分析出哪些特征与治疗反应密切相关。

图5C：展示了验证数据中的特征热图，显示了不同患者群体在ICI反应评分上的分布。

图5D：左侧展示了训练数据中患者的ICI反应评分，右侧则展示了不同ICI反应评分组（CR、PR、PD）之间的RECIST（实体瘤评估标准）结果分布。根据反应评分，患者可以被划分为不同的治疗响应组。

图5E：展示了在IMmotion151训练数据中的PFS，按ICI反应评分分组，结果显示高反应评分组的PFS显著优于低反应评分组。

图5F：展示了ROC-AUC曲线，评估ICI反应评分在区分CR/PR和PD患者中的效果，ROC-AUC为0.77。表明该模型具有较好的区分能力。

图5G：在验证队列（如WU-RCC）中，ICI反应评分较高的患者表现出了较长的PFS，且这些患者的反应评分与实际治疗反应一致，验证了该模型的预测效果。

图5I：展示了ROC-AUC曲线，评估了ICI反应评分在区分完全反应（CR）和进展（PD）患者中的能力。AUC值为0.78，表明该模型具有较高的准确性。

图5J：该图通过Cox比例风险模型评估了ICI反应评分与不同细胞因子、免疫亚型及其他分子标记（如CXCL8、PDL1等）之间的关系。结果表明，ICI反应评分与临床预后密切相关，并能与现有的分子标记进行良好的结合。

特征工程（白盒设计）：

核心特征1：similarity(IE) - similarity(F) —— 免疫富集与纤维化权衡

核心特征2：ECM特征评分 —— 肿瘤可塑性指标

核心特征3-4：CD274(PD-L1)与PDCD1(PD1)表达 —— 检查点活性

核心特征5-6：血管生成 + 增殖FGES —— 肿瘤适应性

算法选择：CatBoost（梯度提升树）+ auto_class_weights=‘balanced’（处理类别不平衡，CR:PD≈1:5）。

模型训练：5折交叉验证，早停（patience=50），学习率0.05。

输出结果：ICI Responder Score ∈ [0,1]，按四分位数分为低（<0.1）、中（0.1-0.4）、高（>0.4）三组。

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Figure 5. ICI and TKI responder score training and validation

这一部分展示了针对TKI（酪氨酸激酶抑制剂）治疗反应的机器学习模型，并评估了TKI反应评分在不同患者群体中的预测效果。

图5K：这一图展示了TKI反应模型的训练和验证流程。该模型的训练数据来自多个队列，如IMmotion151和COMPARZ队列，验证则使用了WU-RCC和JAVELIN队列。训练的目标是根据患者的反应评分来预测他们对TKI的反应。

图5L：该图展示了训练数据中TKI反应评分的热图，显示了不同特征对TKI反应的贡献。特征包括血管生成、巨噬细胞和增殖率等，这些特征在不同患者中表现出不同的强度。

图5M：这是验证数据中的热图，展示了患者的TKI反应评分分布情况。与图5L类似，验证数据也通过热图展示了不同特征对TKI反应评分的影响。

图5N：左侧展示了训练数据中的TKI反应评分，右侧展示了不同反应评分组（CR、PR、PD）之间的RECIST结果分布。可以看出，反应评分较高的患者，尤其是完全反应（CR）组，具有显著的生存优势。

图5O：该图展示了IMmotion151队列中患者的PFS，按TKI反应评分分组。高反应评分组的患者PFS明显较长，这表明TKI反应评分可以有效预测患者的生存期。

图5P：ROC-AUC曲线评估了TKI反应评分在区分完全反应（CR）和进展（PD）患者中的预测能力。AUC为0.74，表明该模型的预测能力较强。

图5Q：Rs的 TKI 应答者评分显著高于NRs（p = 0.0003），而PD样本的评分最低。（p < 0.001；图5Q）左图：验证样本（n = 822）按 RECIST 结果分组的 TKI 应答者评分。Mann-Whitney U检验。右图：验证数据中按 TKI 应答者评分分组的 RECIST 结果比例。卡方检验。

图5R：展示了JAVELIN队列中患者的PFS，按TKI反应评分分组，低反应评分组的患者PFS最差，进一步验证了TKI反应评分对PFS的预测能力。

图5S：ROC-AUC曲线用于评估TKI反应评分在区分完全反应（CR）和进展（PD）患者中的预测能力。AUC值为0.74，表明该模型在预测TKI反应方面具有较好的性能。

图5T：该图通过Cox比例风险模型评估了TKI反应评分与不同临床特征、免疫微环境特征（如增殖、巨噬细胞、血管生成等）之间的关系。结果表明，TKI反应评分与患者的临床预后密切相关，且该模型与现有的生物标记（如增殖率、巨噬细胞等）结合使用时，能进一步提高预测能力。

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Figure 6. An integrated predictive decision-tree model for ICI and TKI response

结论：本部分通过集成的决策树模型进一步优化了ICI和TKI的治疗选择，为个体化治疗提供了依据。

图6A：为了评估我们 ICI 和 TKI 应答评分的临床价值，我们对来自 IMmotion15110,12 的患者进行了 ccRCC 样本分析，这些患者接受了阿替利珠单抗+贝伐珠单抗与舒尼替尼的治疗，并使用了 TKI 和 ICI 应答评分及 PFS 展示了通过决策树模型分类的患者群体，分为ICI/ICI组合优先、TKI优先和非响应组。该模型有助于根据反应评分选择最合适的治疗方案。

图6B：ICI低/TKI低患者群体表现出最差的PFS，提示这些患者需要新的治疗选择。这些肿瘤微环境的特征包括强烈的肌生成标志

图6C：展示了ICI低/TKI低患者群体增加的巨噬细胞、癌相关成纤维细胞、促肿瘤细胞因子和增殖标志；以及低血管化，表明存在免疫抑制、促肿瘤的微环境。提示这些患者需要新的治疗选择。

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Figure 6. An integrated predictive decision-tree model for ICI and TKI response

ICI 和 TKI 应答评分与关键 ccRCC 基因的突变谱显著相关，但并非由其决定。值得注意的是，ICI 低、 TKI 高和 TKI 低的样本分别携带更多 MTOR 、PBRM1 和 BAP1 突变（图 6D），这些基因组特征此前已被证实与治疗反应相关。

图6E：利用 IMmotion151 和 JAVELIN 队列，我们的决策树模型将 56% 的患者分类为 ICI/ICI 联合治疗偏好型，41% 为 TKI 偏好型，3% 为对两者均无反应

图F：生存分析显示，ICI/ICI联合治疗方案优选患者接受阿替利珠单抗+贝伐珠单抗治疗时的 PFS 较舒尼替尼治疗时增加（IMmotion151，p=0.00005），接受avelumab+阿昔替尼治疗时较舒尼替尼治疗时增加（javelin，p=0.000007，图6F）。

在接受舒尼替尼治疗的 TKI 首选患者中也观察到更长的 PFS（中位 PFS =14个月），与接受贝伐珠单抗+阿替利珠单抗治疗的患者相比（中位 PFS =10个月，p=0.06）。

如预期的那样，在接受含 TKI 治疗的TKI首选患者中，接受阿维鲁单抗+阿昔替尼（A+A）或舒尼替尼治疗的患者中未观察到差异（p=1.0；图6G）。

图6G：采用 RECIST 结果和治疗方案的条形图，显示接受舒尼替尼(S)、阿替利珠单抗(A)及阿替利珠单抗联合贝伐珠单抗（A+B）治疗的IMmotion151（左）和IMmotion150（右）患者。样本分为ICI/ICI组合或 TKI 首选类别。

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Figure 7. Analysis of ccRCC MxIF-based cellular communities

这一页展示的是空间细胞社区与免疫/靶向治疗反应的关系。核心结论是：不同的细胞社区比例可以进一步细分传统转录组预测的响应者，从而提升患者筛选精度。

首先看 7A。这张图把 34 例 MxIF 样本的 15 个社区做成热图，每列是一位患者。虚线框标出了 5 例 ICI 治疗 progressive-disease（PD）患者。我们一眼就能看到，这些 PD 患者普遍富集了 E1 社区——也就是 Ki67+ 肿瘤细胞的区域；而 3 例 complete-response（CR）患者则更多呈现 E2 社区，提示非增殖性肿瘤细胞区域可能与良好响应相关。

接着 7B。箱线图比较了关键社区与 HiTME 亚型及 TKI 响应评分的关系。左侧纵轴是社区比例。可以看到：
I1 社区（CD206+ 巨噬细胞为主）在 F 亚型中显著升高，p < 0.05；
I2 社区（CD68+ 巨噬细胞）和 M1 社区在 IE/M 亚型中显著升高；
V1 社区（血管相关）与 TKI 响应评分显著正相关，p < 0.001。
这些结果说明，空间层面的社区分布不仅与转录组亚型吻合，还能直接关联到靶向治疗评分。
最后 7C。散点图把 13 例接受 ICI 治疗的患者按 E1-E2 社区差异（横轴）和 AI 预测的 ICI 响应评分（纵轴）进行展示。红色圆点代表 PD，绿色圆点代表 CR。可以看到，绝大多数 CR 患者落在右上象限——即 E2 高、ICI 评分高；而唯一一个被模型误判为“高响应”的 PD 样本，其实 E1 比例也很高。这提示我们把空间社区信息纳入模型后，可以纠正传统转录组的误判，提高预测准确率。”

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Figure 7. Analysis of ccRCC MxIF-based cellular communities
这一页聚焦细胞因子程序如何驱动空间社区，并进一步验证其与治疗评分的关联。结论可以概括为：三类细胞因子群组分别对应免疫激活、免疫抑制和血管生成，且与 ICI 或 TKI 评分高度耦合。
先看 7D。热图展示 48 种细胞因子/趋化因子与 MxIF 社区、ICI/TKI 响应评分以及 HiTME 亚型相似度的皮尔逊相关系数。聚类后得到三大群组：
Group 1（黄色框）：包括 CXCL13、IFNG、CCL5 等，与 ICI 响应评分正相关，主要富集在 M1、T1、B1、I2 这些免疫活跃社区；
Group 2（橙色框）：如 CXCL8、IL6、CCL18，与 F 亚型及 CD206+ 社区正相关，提示免疫抑制；
Group 3（蓝色框）：如 VEGFA、EPAS1、TGFB，与 TKI 响应评分正相关，富集在血管化社区 V1、E5/V。
颜色越红代表正相关越强，越蓝代表负相关。
接着 7E。气泡图用单细胞 RNA-seq 验证这些细胞因子的细胞来源。气泡大小表示表达该因子的细胞比例。可以看到：
CCL5 主要由 CD8+ T 和 NK 细胞产生；
CXCL8 和 CCL18 主要来自巨噬细胞和成纤维细胞；
EPAS1 则几乎 exclusively 由内皮细胞表达。
这为我们提供了“谁在说这些信号”的细胞层面证据。
最后 7F。UMAP 降维图把 22,456 个单细胞按类型着色，并在右侧小图里展示 CCL5 和 EPAS1 的表达分布。红色越深表达越高。可以直观看到：CCL5 集中在 T/NK 细胞群，而 EPAS1 集中在内皮细胞群。这与 7D、7E 的推论完全一致，也再次证明空间-转录组-单细胞多模态整合的必要性。”

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Summary of the major findings

图 1 先在 WU-RCC 小队列里告诉我们：传统单指标（突变、PD-L1、CD8 计数）无法区分免疫/靶向治疗反应者；于是图 2 把 3,621 例样本拉通，用 33 个功能基因签名无监督聚出 5 个 HiTME 亚型，证明肿瘤微环境本身就能决定预后。
为了验证这些亚型不是‘纸上分型’，图 3 用 MxIF 空间蛋白组在 34 例组织上‘眼见为实’：IE/M 和 F 亚型确实富含 CD206+ 巨噬细胞，V 亚型血管密集，且与转录组结果高度吻合。
接着图 4 把视野再放大，用 15 个细胞社区展示肿瘤-间质边界的空间生态：IE/M 亚型在肿瘤边缘堆积免疫抑制社区，而 V 亚型则把血管社区推进肿瘤核心，为后续治疗预测提供空间坐标。
有了可信的分型和空间地图，图 5 才训练 AI：把基因组、转录组、微环境特征一起喂给梯度提升树，得到 ICI 和 TKI 两个响应评分；在 6 个独立队列里，这两个评分都比既往任何单一 biomarker 更准地区分 CR/PD。
图 6 把评分落地成临床决策树：ICI-high/TKI-low 患者吃 ICI+AA 获益最大，TKI-preferred 患者吃 TKI 单药 PFS 更长，而 3% 双低患者对两者都不敏感，提示需要全新方案。

最后图 7 用细胞社区和细胞因子再往前一步：把空间信息加进模型后，原本被误判的 PD 样本被重新识别；同时发现三类细胞因子（免疫激活、免疫抑制、血管生成）分别驱动不同社区，从而解释了为什么 ICI 和 TKI 评分能够精准预测疗效。”

数据层： 组合疗法覆盖不全：缺少lenvatinib+pembrolizumab和nivolumab+cabozantinib数据，模型在最新SOC上未验证。未来需纳入CheckMate-9ER等试验。
单药ICI数据缺乏：无法评估avelumab或nivolumab单药场景，模型仅验证ICI+AA或ICI+TKI。
方法层：
3. 回顾性验证为主：尽管有WU-RCC（n=193）独立队列，但仍属回顾性。亟需前瞻性试验（如PROSPERO注册研究）在初治患者中验证。
4. 小样本空间验证：MxIF仅34例，罕见社区（如TLS）统计效能有限。需扩大至100+例并多中心验证。
技术层：
5. Harmonization的信息损失：批次内标准化可能掩盖队列特异性生物学（如种族差异，Wang et al. 2020的亚洲ccRCC研究）。未来需开发批次自适应微调策略。
6. 突变注释深度：仅分析WES数据的MTOR/AP基因，未评估结构变异（如VHL 3p缺失）和表观调控（如PBRM1失活对免疫微环境的重塑）。
伦理与可及性：
7. 成本问题：RNA-seq与MxIF成本高昂，限制在资源有限地区应用。需探索简化panel（如RT-PCR测6个核心基因）或数字病理AI（H&E预测HiTME）作为替代。